Precisa de uma abordagem pessoal e exclusiva?

Para que gastar seu tempo procurando trabalhos prontos online? Tente nosso serviço agora mesmo!

Determinação da Experiência de Concentração de Proteína

RESUMO :

O objetivo deste experimento é determinar as concentrações de RNase H que foram purificadas no experimento de laboratório anterior e de uma solução desconhecida, que foi administrada pela AT. Um reagente Bradford foi utilizado para determinar a concentração total que se liga à proteína. As amostras foram colocadas em um espectrofotômetro e a absorvância foi registrada para cada amostra. Os dados foram comparados com a curva de calibração feita usando as soluções de proteína padrão e a leitura de absorvância. Nossa amostra foi desconhecida # 3, que tinha uma concentração total de 1.418 mg/mL. As concentrações para o fluxo original através do fluxo de tampão de lavagem e o fluxo de tampão de eluição foram 0,021 mg/mL, 0,0274 mg/mL e 0,014 mg/mL, respectivamente, com um intervalo de confiança de 98% de ± 0,0021%.

  1. INTRODUÇÃO :

No experimento de laboratório anterior, a proteína His-tag RNase H foi purificada implementando um método chamado cromatografia de afinidade. A cromatografia de afinidade é utilizada para isolar e purificar proteínas devido à sua alta selectividade para a proteína de interesse (Bioquímica, 2015). O buffer de eluição não utilizado, o fluxo de fluxo original, o fluxo de fluxo de eluição e o fluxo do buffer de lavagem foram todos retidos e armazenados para o último experimento # 7. Além das soluções mencionadas, cinco soluções padrão de proteína são preparadas por diluição de 1,56 mg/mL de solução de globulina bovina (IgG) e tampão de eluição não utilizado. A solução preparada final é colocada em um espectrofotômetro e ajustada a uma absorvância de 596 nm. O buffer de eluição não utilizado é usado como o controle na experiência para equilibrar o espectrofotômetro.

  1. RESULTADOS :
  1. TABELAS DE DADOS:
  • Soluções de Proteínas Padrão:

Concentração de proteína (mg/mL)

Volume de 1,56 mg/mL Solução de reserva de IgG necessária (μL)

Volume de tampão de eluição não utilizado usado (μ)

Volume total de solução

0,25

40

210

Como funciona?

O estudante
Faz o pedido

O livro «Medicine River» é interessante e atraente para os leitores. Existem algumas situações

Escritores fazem
suas propostas

O livro «Medicine River» é interessante e atraente para os leitores. Existem algumas situações

O estudante
contrata um eskritor

O livro «Medicine River» é interessante e atraente para os leitores. Existem algumas situações

O escritor produz
o trabalho

O livro «Medicine River» é interessante e atraente para os leitores. Existem algumas situações

250 μl

0,50

80

170

250 μl

0,75

120

130

250 μl

1.0

160

90

250 μl

1.5

240

10

250 μl

  • Dados de Absorvância :

Concentrações (mg/mL)

Absorbância a 596 nm

Definir 1

Set 2

Média

1.50

0.608

0.633

0.621

1.00

0.455

0,423

0,439

0,75

0.441

0.246

0.344

0,50

0,162

0,307

0,235

0,25

0,043

0,056

0,050

EB não utilizado (Controle) = 0

0.000

0.000

0.000

fluxo original através de

0,004

-0,003

0,001

Tampão de lavagem

0,002

0,005

0,004

Eluting Buffer

0,001

-0.004

-0,002

Amostra Desconhecida # 3

0.608

0.606

0.607

  • Concentração total :

Amostra de Proteína

Concentração (mg/mL)

fluxo original através de

0,0205

Tampão de lavagem

0,0274

Eluting Buffer

0,0136

Amostra Desconhecida # 3

1.418

  1. GRÁFICO :
  1. CÁLCULOS :

A expressão dada pela tendência linear de melhor ajuste será usada para determinar as concentrações para o fluxo original, o fluxo de lavagem, o fluxo de fluxo de eluição e a amostra desconhecida # 3. Onde y-representa a absorvância, e x-representa a concentração. As unidades correspondentes à inclinação estão em mg/mL. A equação da inclinação é: y = 0.4336 x â '0.0079. A resolução de x nos dará as concentrações das amostras.

  • Concentração do fluxo original através de :
  • Reorganizar para resolver x:
  • y = 0.4336 x â '0.0079  x = (y - 0.0079)/(0.4336)

(0.001) = 0.4336 x â '0.0079

x = (0,001 + 0,0079)/(0,4336)

x = 0,0205 mg/mL 0,021 mg/mL

CÁLCULOS: (continuação)

  • Concentração do fluxo de buffer de lavagem através :
  • y = 0.4336 x â '0.0079

(0.004) = 0.4336 x â '0.0079

x = (0.004 + 0.0079)/(0.4336)

x = 0,0274 mg/mL 0,027 mg/mL

  • Concentração de fluxo de buffer de eluição através :
  • y = 0.4336 x â '0.0079

(- 0.002) = 0.4336 x â '0.0079

x = (-0.002 + 0.0079)/(0.4336)

x = 0,0136 mg/mL 0,014 mg/mL

  • Concentração da Solução Desconhecida # 3 :
  • y = 0.4336 x â '0.0079

(0.607) = 0.4336 x â '0.0079

x = (0.607 + 0.0079)/(0.4336)

x = 1.418 mg/mL

  1. DISCUSSÃO :

O objetivo principal para este experimento foi determinar a concentração protéica do fluxo original, o fluxo de tampão de lavagem através do fluxo de tampão de eluição e uma amostra desconhecida fornecida pelo TA. Essas amostras além do desconhecido foram preparadas no experimento de laboratório anterior e foram mantidas para análises adicionais para esta experiência. Além das amostras mencionadas acima, foram preparadas cinco soluções de proteína padrão diluindo a solução de 1,56 mg/mL de IgG com o tampão de eluição não utilizado obtido a partir do laboratório # 6. As concentrações dos padrões foram as seguintes: 0,25 mg/mL 0,50 mg/mL, 0,75 mg/mL, 1,0 mg/mL e 1,5 mg/mL. O tampão de eluição não utilizado também foi usado como controle. Era evidente que ao adicionar o reagente Bradford às amostras, havia uma mudança de cor visível. Algumas das soluções viraram instantaneamente para uma tonalidade azul mais escura, enquanto outras permaneceram de cor azul claro. A cor mais escura indicou que houve uma maior concentração de proteínas.

Uma curva de calibração foi gerada ao traçar as concentrações dos cinco padrões e sua respectiva leitura de absorvância. Determinou-se que o melhor ajuste para os dados era linear, o que produz uma equação na forma de y = mx + b, onde y representa a absorvância a 596 nm e x representa a concentração de proteína. A equação foi rearranjada quanto a resolver para x e determinar a concentração de proteína das amostras e o desconhecido # 3, com base nos dados das médias dos dois conjuntos de absorvência medidos. No entanto, dois valores do conjunto dois deram leituras negativas, o que era indicativo de que a concentração da proteína era menor que a da amostra de controle.

De acordo com os meus resultados, concluiu-se que a nossa amostra desconhecida tinha uma concentração total de proteína de 1,418 mg/mL. As concentrações para o fluxo através da solução original, tampão de lavagem e tampão de eluição tinham uma concentração total de proteína de 0,0205 mg/mL, 0,0274 mg/mL e 0,0136 mg/mL, respectivamente. Os dados de absorvência foram analisados ​​adicionalmente usando um intervalo de confiança de 98% e produziram um erro de margem de ± 0,002%. O valor R foi relativamente próximo de 1, o que dá uma equação mais precisa. Isso também indica que os valores calculados para a concentração da proteína refletirão um valor mais próximo da concentração real da proteína de interesse.

  1. REFERENCES :
  1. J. M. Berg, J. L. Tymoczko, G. J. Gatto, Jr., amp; L. Stryer, Bioquímica (8ª ed., Pp. 70-71). (2015). W.H. Freeman amp; Empresa.
  2. Bradford, M. M. Bioquímica analítica . Volume 72. Um Método Rápido e Sensível para a Quantificação de Quantidades de Microgramas de Proteínas Utilizando o Princípio da Vinculação com Proteína-Tintura. (pp. 248-254). (1976).
  3. Robyt, J. F. e White, B. J. Técnicas bioquímicas. Teoria e Prática. Brooks/Cole, Monterey, CA. (1997)
  4. li>

    Você triturou para o tempo?

    Temos melhores preços, confira você mesmo!

    Deadline
    Pages
    ~ 550 words
    Nosso Preço
    R$ 0
    Preço dos concorrentes
    R$ 0

    VOCE PODE GOSTAR