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Diagnosticando a Diabetes Mellitus

Introdução

Nesta prática, ensaios enzimáticos foram utilizados para determinar a concentração de glicose de pacientes em amostras de plasma. O uso de enzimas como marcador para análise analítica de amostras de plasma é muito confiável devido à alta especificidade, reprodutibilidade e sensibilidade dos ensaios enzimáticos (kit de teste de glicose HK).

O primeiro ensaio utilizado é um teste de glucose oxidase, este ensaio mede os níveis de glicose no plasma utilizando enzimas tais como glucose oxidase para catalisar a oxidação de D-glucose que está presente no plasma em ácido D-Glucónico. A reação é acoplada a outra reação química onde uma forma reduzida de o-diansidina é oxidada a uma forma oxidada de o-diansidina. Isso ocorre em combinação com uma formação de peróxido de hidrogênio. O peróxido de hidrogênio é então quebrado e reage com H2SO4 para formar um composto colorido que pode ser detectado por espectrofotometria em um comprimento de onda de 540nm.

Outro teste de medição de glicose popular é o ensaio de hexoquinase. Este ensaio catalisa a fosforilação da glucose presente na amostra em presença de trifosfato de adenosina (ATP) usando hexoquinase para formar glicose-6-fosfato (G6P). G6P é então oxidado na presença de dinucleótido de nicotinamida adenina (NAD) para formar 6-fosfo-gluconato, esta reacção é catalisada pela presença de glucose-6-fosfato desidrogenase (G6PDH). Enquanto esta reação está passando, o NAD é reduzido a NADH. Isso cria um sinal colorimétrico que pode ser detectado em um comprimento de onda de 340nm por um espectrofotômetro.

Tabela 4. Absorvância padrão

Padrões (mM)

0.000

5.000

10.000

Como funciona?

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15.000

20.000

25.000

Absorbância

Data: 25/01/2017

0,049

0,144

0.291

0.442

0,545

0.640

Data: 25/01/2017

0,048

0.193

0.283

0,410

0,567

0.686

Média

0.049

0.169

0.287

0.426

0.556

0.663

Desvio padrão (n = 2)

0,001

0.035

0,006

0.023

0.016

0.033

CV% (n = 2)

1.458

20.563

1.971

5.312

2.798

4.906

Tabela 5. Padrões significa recapitulativo de absorção

Padrões

Concentração (mM)

Abs

1

0

0,049

2

5

0,166

3

10

0.287

4

15

0.426

5

20

0,556

6

25

0.663

Uma curva padrão pode ser plotada usando os resultados gerados pelos poços que contêm os padrões.

Figura 1. Curva padrão da absorção versus concentração

A precisão da curva padrão pode ser determinada calculando o coeficiente de variação (CV% em que CV = desvio padrão (SD)/média) para cada padrão como mostrado abaixo:

Figura 2. Comparação dos coeficientes de porcentagens de variação das duplicatas padrão

Os resultados são geralmente rejeitados se a diferença de valores for superior a 20% para mais de 75% dos padrões de calibração. Neste caso, a precisão da curva é aceitável, uma vez que todos os CVs dos pontos (exceto de 1) são inferiores a 20% (EMEA ou Desilva).

A precisão e a precisão podem ser analisadas pelos controles de qualidade (QCs) que foram executados em duplicado na placa.

Tabela 6. Resultados do controle de qualidade

Absorbância

Resultados

QC (4 mM)

QC (7 mM)

QC (11 mM)

0,126

0.193

0.266

0.129

0,204

0.303

Média

0.128

0.199

0.285

Desvio padrão (n = 2)

0.002

0,008

0.026

CV% (n = 2)

1.664

3.918

9.196

Conforme mostrado acima, os currículos dos QCs são inferiores a 20%, o que significa que a precisão das duplicatas é aceitável.

Ao extrapolar a absorvância média dos QCs, as concentrações correspondentes podem ser determinadas. Os desempenhos de QC são determinados pelo cálculo da precisão e precisão destes. A precisão é determinada como CV% (CV%, onde CV = SD/média) e a precisão como viés absoluto (% RE, onde erro relativo [RE] = [valor medido - valor real]/valor real). Se estes estão entre ± 20% (± 25% para QC baixo e QC alto) e o erro total alvo (soma destes dois valores) é inferior a 30% (40% para QC baixo e alto QC), os resultados gerados a partir de a curva padrão é aceitável (De silva EMEA).

Tabela 7. Precisão e precisão de controle de qualidade

QC (4 mg/ml)

QC (7 mg/ml)

QC (11 mg/ml)

Absorbância

0,128

0.199

0.285

Concentração

3.29

6.13

9.57

CV% (n = 2)

2.595

5.092

10.958

Bias%

17.8583547

12.48608

13.03319986

Erro total

20.453

17.578

23.992

Seguindo os resultados mostrados acima, pode-se determinar que a precisão e precisão dos resultados são aceitáveis ​​para cada controle.

Uma vez que este foi determinado, os resultados gerados a partir das amostras podem ser analisados ​​de forma confiável.

Finalmente, extrapolando a absorvância gerada a partir das amostras na curva padrão, uma concentração correspondente pode ser determinada como mostrado abaixo:

Tabela 8. Resultados da amostra

Paciente1 (t = 1)

Paciente 1 (t = 2)

Paciente 2 (t = 1)

Paciente 2 (t = 2)

Paciente 3 (t = 1)

Paciente 3 (t = 2)

absorvância

0.130

0,159

0,095

0,126

0,09

0,087

Concentração (nM)

3.37

4.53

1.97

3.21

1.77

1.65

  1. Ensaio de Hexokinase

Devido a restrições de tempo, o ensaio de hexoquinase não foi realizado. Apesar disso, foram fornecidos alguns resultados para determinar as concentrações de glicose dos 3 pacientes.

Resultados

Tabela 9. Padrões, controles de qualidade e resultados de amostras fornecidos

Padrões:

Concentração de glicose mM

Absorbância

0

0,048

5

0.154

10

0.366

15

0.496

20

0,725

25

0.854

Amostras e controles de qualidade:

Exemplo

Absorbância

IQC1

0,162

IQC2

0,260

IQC3

0,393

Paciente 1 amostra 1

0.269

Paciente 1 amostra 2

0.411

Paciente 2 amostra 1

0.196

Paciente 2 amostra 2

0.303

Paciente 3 amostra 1

0,206

Paciente 3 amostra 2

0,236

Uma curva padrão pode ser plotada usando os resultados padrão fornecidos:

Figura 3. Curva padrão de absorvância sobre a concentração

Ao extrapolar a absorvância dos controles de qualidade e amostras, as concentrações correspondentes podem ser determinadas como mostrado abaixo:

Tabela 10. Resultados do controle de qualidade

QC (4)

QC (7)

QC (11)

Absorbância

0,162

0,26

0,393

Concentração (nM)

4.27

7.16

11.10

Bias%

6.68430505

2.347304

0.871558008

O viés calculado está dentro da faixa de 20%, o que significa que o ensaio é preciso e os resultados gerados são validados.

Finalmente, extrapolando a absorvância fornecida das amostras na curva padrão, pode-se determinar uma concentração correspondente.

Tabela 11. Resultados da amostra

Paciente1 (t = 1)

Paciente 1 (t = 2)

Paciente 2 (t = 1)

Paciente 2 (t = 2)

Paciente 3 (t = 1)

Paciente 3 (t = 2)

absorvância

0.269

0.411

0.196

0.303

0,206

0,236

Concentração (nM)

7.43

11.63

5.27

8.44

5.57

6.45

Discussão

Os resultados obtidos pelo teste de glucose oxidase são muito diferentes do ensaio de hexoquinase, mesmo que a precisão e precisão de ambos os ensaios sejam aceitáveis. O que significa que deve haver um erro na preparação das amostras, padrões ou controles de um desses ensaios. Foi predeterminado que um erro pré-analítico foi feito durante o armazenamento das amostras do paciente antes do seu uso no teste de glicose oxidase. As amostras foram descongeladas e não mantidas em gelo que degradaram as amostras, o que explica os baixos valores para as concentrações do paciente. Devido aos resultados anormais obtidos no teste de glicose oxidase (t = 1 e t = 2 diminuição nas concentrações de glicose para o paciente 3), os resultados foram omitidos de uma interpretação clínica adicional. Os resultados fornecidos no ensaio de hexoquinase parecem ser mais corretos (aumento das concentrações de glicose de t = 1 para t = 2). Levando isso em consideração, os resultados obtidos com o ensaio de hexoquinase foram utilizados para a interpretação clínica dos pacientes.

As amostras pareadas que foram executadas nos ensaios foram amostras coletadas durante um teste de tolerância à glicose. Um teste de tolerância à glicose (comumente chamado GTT ou OGTT) é realizado em um paciente para ajudar a diagnosticar diabetes. Ele é usado para ajudar a diagnosticar distúrbios como pré-diabetes, resistência à insulina, diabetes gestacional (para mulheres grávidas) e hipoglicemia reativa, por exemplo. O teste envolve a administração de uma dose de glicose (geralmente 75g em forma líquida) para um paciente em jejum. O sangue é tomado antes da ingestão da dose e 2 horas depois. Os resultados dos níveis de glicose no sangue ajudam a determinar os distúrbios da glicose (ref).

GTT é uma ferramenta amplamente utilizada para diagnosticar diabetes gestacional. É oferecido a mulheres com 24 a 28 semanas de gravidez e apresentam fatores de risco, como um IMC elevado, história familiar de diabetes ou uma gravidez anterior de um bebê grande. Paciente 1 é uma mulher de 36 anos com gravidez de 28 semanas. Foi oferecida uma GTT de rotina após a última gravidez desde que o bebê era grande. Sua glicemia em jejum foi de 7,43 mmol/L e seus níveis de glicose no sangue após 2 horas foi de 11,6 mmol/L. No Reino Unido, de acordo com as diretrizes do Instituto Nacional de Saúde e Assistência (NICE), uma glicemia de jejum superior a 5,6 mmol/L e/ou um nível de glicemia de 2 horas superior a 7,8mmol/L para gestantes é considerado diagnóstico para diabetes gestacional (NICE guidleines). Portanto, o paciente em questão é diagnosticado com diabetes gestacional.

Paciente 2 é uma fêmea de 67 anos, ela foi encaminhada para um GTT após os resultados de sua glicemia de jejum de 5,6mmol/L em um check-up de rotina de GP. De acordo com os resultados do ensaio de hexoquinase, sua glicemia de jejum foi de 5,27 mmol/L e seus níveis de glicose plasmática de 2 horas foram de 8,44 mmol/L. Estes resultados indicam que o paciente tem uma tolerância à glicose prejudicada (glicemia em jejum com menos de 7mmol/L e 2 horas de plasma entre 7,8 e 11,1 mmol/L). Este diagnóstico é dado quando os resultados não indicam diabetes, mas ainda são anormais. Mais check-ups precisam ser planejados para verificar rotineiramente o diabetes.

Paciente 3 é um homem de 24 anos de idade. Ele é afetado pela fibrose cística que requer testes anuais de função pancreática, como GTTs. Seus níveis de glicemia em jejum foram de 5,57 mmol/L e os níveis de glicose no sangue de 2 horas foram de 6,45 mmol/L, seguindo esses resultados, é seguro dizer que esse paciente é saudável (níveis plasmáticos em jejum inferiores a 5,5 mmol/L e níveis plasmáticos de glicose em 2 horas menos que 7.8mmol/L).

Conclusão

Ao usar um ensaio enzimático, os níveis de glicose no sangue dos pacientes podem ser monitorados. Esses ensaios são confiáveis ​​devido à especificidade, reprodutibilidade e sensibilidade das enzimas. Ao medir os níveis de glicose das amostras antes e após a administração de uma dose oral de glicose, os resultados podem ajudar a diagnosticar vários tipos de diabetes, como o diabetes gestacional em mulheres grávidas. Há uma variedade de ensaios disponíveis que podem medir a glicose a partir de amostras de soro, mas todos funcionam com o mesmo princípio de catalisar uma reação para produzir um sinal detectável que esteja correlacionado com uma concentração. O uso de controles internos de qualidade é uma maneira indispensável de testar a confiabilidade dos resultados.

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