Precisa de uma abordagem pessoal e exclusiva?

Para que gastar seu tempo procurando trabalhos prontos online? Tente nosso serviço agora mesmo!

Determinação da Experiência de Concentração de Proteína

RESUMO :

O objetivo deste experimento é determinar as concentrações de RNase H que foram purificadas no experimento de laboratório anterior e de uma solução desconhecida, que foi administrada pela AT. Um reagente Bradford foi utilizado para determinar a concentração total que se liga à proteína. As amostras foram colocadas em um espectrofotômetro e a absorvância foi registrada para cada amostra. Os dados foram comparados com a curva de calibração feita usando as soluções de proteína padrão e a leitura de absorvância. Nossa amostra foi desconhecida # 3, que tinha uma concentração total de 1.418 mg/mL. As concentrações para o fluxo original através do fluxo de tampão de lavagem e o fluxo de tampão de eluição foram 0,021 mg/mL, 0,0274 mg/mL e 0,014 mg/mL, respectivamente, com um intervalo de confiança de 98% de ± 0,0021%.

  1. INTRODUÇÃO :

No experimento de laboratório anterior, a proteína His-tag RNase H foi purificada implementando um método chamado cromatografia de afinidade. A cromatografia de afinidade é utilizada para isolar e purificar proteínas devido à sua alta selectividade para a proteína de interesse (Bioquímica, 2015). O buffer de eluição não utilizado, o fluxo de fluxo original, o fluxo de fluxo de eluição e o fluxo do buffer de lavagem foram todos retidos e armazenados para o último experimento # 7. Além das soluções mencionadas, cinco soluções padrão de proteína são preparadas por diluição de 1,56 mg/mL de solução de globulina bovina (IgG) e tampão de eluição não utilizado. A solução preparada final é colocada em um espectrofotômetro e ajustada a uma absorvância de 596 nm. O buffer de eluição não utilizado é usado como o controle na experiência para equilibrar o espectrofotômetro.

  1. RESULTADOS :
  1. TABELAS DE DADOS:
  • Soluções de Proteínas Padrão:

Concentração de proteína (mg/mL)

Volume de 1,56 mg/mL Solução de reserva de IgG necessária (μL)

Volume de tampão de eluição não utilizado usado (μ)

Volume total de solução

0,25

40

210

250 μl

0,50

80

170

250 μl

0,75

120

130

250 μl

1.0

160

90

250 μl

1.5

240

10

250 μl

  • Dados de Absorvância :

Concentrações (mg/mL)

Absorbância a 596 nm

Definir 1

Set 2

Média

1.50

0.608

0.633

0.621

1.00

0.455

0,423

0,439

0,75

0.441

0.246

0.344

0,50

0,162

0,307

0,235

0,25

0,043

0,056

0,050

EB não utilizado (Controle) = 0

0.000

0.000

0.000

fluxo original através de

0,004

-0,003

0,001

Tampão de lavagem

0,002

0,005

0,004

Eluting Buffer

0,001

-0.004

-0,002

Amostra Desconhecida # 3

0.608

0.606

0.607

  • Concentração total :

Amostra de Proteína

Concentração (mg/mL)

fluxo original através de

0,0205

Tampão de lavagem

0,0274

Eluting Buffer

0,0136

Amostra Desconhecida # 3

1.418

  1. GRÁFICO :
  1. CÁLCULOS :

A expressão dada pela tendência linear de melhor ajuste será usada para determinar as concentrações para o fluxo original, o fluxo de lavagem, o fluxo de fluxo de eluição e a amostra desconhecida # 3. Onde y-representa a absorvância, e x-representa a concentração. As unidades correspondentes à inclinação estão em mg/mL. A equação da inclinação é: y = 0.4336 x â '0.0079. A resolução de x nos dará as concentrações das amostras.

  • Concentração do fluxo original através de :
  • Reorganizar para resolver x:
  • y = 0.4336 x â '0.0079  x = (y - 0.0079)/(0.4336)

(0.001) = 0.4336 x â '0.0079

x = (0,001 + 0,0079)/(0,4336)

x = 0,0205 mg/mL 0,021 mg/mL

CÁLCULOS: (continuação)

  • Concentração do fluxo de buffer de lavagem através :
  • y = 0.4336 x â '0.0079

(0.004) = 0.4336 x â '0.0079

x = (0.004 + 0.0079)/(0.4336)

x = 0,0274 mg/mL 0,027 mg/mL

  • Concentração de fluxo de buffer de eluição através :
  • y = 0.4336 x â '0.0079

(- 0.002) = 0.4336 x â '0.0079

x = (-0.002 + 0.0079)/(0.4336)

x = 0,0136 mg/mL 0,014 mg/mL

  • Concentração da Solução Desconhecida # 3 :
  • y = 0.4336 x â '0.0079

(0.607) = 0.4336 x â '0.0079

x = (0.607 + 0.0079)/(0.4336)

x = 1.418 mg/mL

  1. DISCUSSÃO :

O objetivo principal para este experimento foi determinar a concentração protéica do fluxo original, o fluxo de tampão de lavagem através do fluxo de tampão de eluição e uma amostra desconhecida fornecida pelo TA. Essas amostras além do desconhecido foram preparadas no experimento de laboratório anterior e foram mantidas para análises adicionais para esta experiência. Além das amostras mencionadas acima, foram preparadas cinco soluções de proteína padrão diluindo a solução de 1,56 mg/mL de IgG com o tampão de eluição não utilizado obtido a partir do laboratório # 6. As concentrações dos padrões foram as seguintes: 0,25 mg/mL 0,50 mg/mL, 0,75 mg/mL, 1,0 mg/mL e 1,5 mg/mL. O tampão de eluição não utilizado também foi usado como controle. Era evidente que ao adicionar o reagente Bradford às amostras, havia uma mudança de cor visível. Algumas das soluções viraram instantaneamente para uma tonalidade azul mais escura, enquanto outras permaneceram de cor azul claro. A cor mais escura indicou que houve uma maior concentração de proteínas.

Uma curva de calibração foi gerada ao traçar as concentrações dos cinco padrões e sua respectiva leitura de absorvância. Determinou-se que o melhor ajuste para os dados era linear, o que produz uma equação na forma de y = mx + b, onde y representa a absorvância a 596 nm e x representa a concentração de proteína. A equação foi rearranjada quanto a resolver para x e determinar a concentração de proteína das amostras e o desconhecido # 3, com base nos dados das médias dos dois conjuntos de absorvência medidos. No entanto, dois valores do conjunto dois deram leituras negativas, o que era indicativo de que a concentração da proteína era menor que a da amostra de controle.

De acordo com os meus resultados, concluiu-se que a nossa amostra desconhecida tinha uma concentração total de proteína de 1,418 mg/mL. As concentrações para o fluxo através da solução original, tampão de lavagem e tampão de eluição tinham uma concentração total de proteína de 0,0205 mg/mL, 0,0274 mg/mL e 0,0136 mg/mL, respectivamente. Os dados de absorvência foram analisados ​​adicionalmente usando um intervalo de confiança de 98% e produziram um erro de margem de ± 0,002%. O valor R foi relativamente próximo de 1, o que dá uma equação mais precisa. Isso também indica que os valores calculados para a concentração da proteína refletirão um valor mais próximo da concentração real da proteína de interesse.

  1. REFERENCES :
  1. J. M. Berg, J. L. Tymoczko, G. J. Gatto, Jr., amp; L. Stryer, Bioquímica (8ª ed., Pp. 70-71). (2015). W.H. Freeman amp; Empresa.
  2. Bradford, M. M. Bioquímica analítica . Volume 72. Um Método Rápido e Sensível para a Quantificação de Quantidades de Microgramas de Proteínas Utilizando o Princípio da Vinculação com Proteína-Tintura. (pp. 248-254). (1976).
  3. Robyt, J. F. e White, B. J. Técnicas bioquímicas. Teoria e Prática. Brooks/Cole, Monterey, CA. (1997)

Como funciona?

O estudante
Faz o pedido

O livro «Medicine River» é interessante e atraente para os leitores. Existem algumas situações

Escritores fazem
suas propostas

O livro «Medicine River» é interessante e atraente para os leitores. Existem algumas situações

O estudante
contrata um eskritor

O livro «Medicine River» é interessante e atraente para os leitores. Existem algumas situações

O escritor produz
o trabalho

O livro «Medicine River» é interessante e atraente para os leitores. Existem algumas situações

Você triturou para o tempo?

Temos melhores preços, confira você mesmo!

Deadline
Pages
~ 550 words
Nosso Preço
R$ 0
Preço dos concorrentes
R$ 0

VOCE PODE GOSTAR