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Constante de ligação de medição do brometo de etídio (EtBr) ...

RESUMO:

O princípio por trás deste experimento de laboratório foi determinar a constante de ligação do brometo de etidio ao DNA usando as concentrações conhecidas e o valor calculado de X obtido a partir da equação. O brometo de etidio é dito ter uma alta afinidade com o DNA, portanto, o valor esperado para a constante de ligação deve ser grande. Dois métodos foram implementados na determinação da constante de ligação de EtBr ao DNA. O primeiro método foi inserindo os dados de absorvência usando uma planilha de Excel fixa. O objetivo principal era manipular o valor na célula I24 para ser o mais baixo possível. Após várias trilhas e erros, o valor final da célula I24 foi de 0,00011316 e logK foi de 3,99. O segundo método foi por simples cálculo manual. Os dois métodos renderam dois resultados muito diferentes. Por cálculo manual, o valor obtido para K era 37,108,63 M -1 , o que era indicativo de que o complexo EB final do DNA era maior do que o DNA não ligado e EB não ligado. O alto valor da constante de ligação (K), demonstra que existe uma alta afinidade do brometo de etidio com o DNA. Isso se correlaciona com os valores esperados de EtBr, que são relatados entre 10 4 M a 10 6 M.

  1. INTRODUÇÃO:

O DNA desempenha um papel importante nos sistemas biológicos, sendo que contém materiais hereditários que são transmitidos às gerações após as gerações. O DNA contém sequências de bases específicas dentro das cadeias de DNA onde armazena informações genéticas que podem ser prontamente replicadas (Jeremy M. Berg, 2015). É esta seqüência que determina a seqüência de RNA e outras moléculas de proteína e também transporta a maioria das atividades dentro das células. A síntese de ARN é um passo fundamental na expressão da informação genética (Jeremy M. Berg, 2015, p. 859). O DNA é mais do que apenas uma fonte de informação de seqüência, mas também é a plataforma onde as proteínas de ligação se agrupam. Este é um fator importante para o desenvolvimento de muitos medicamentos clínicos. A estrutura e a função dos alvos de drogas são a base para projetos de inibidores efetivos e específicos. Embora seja considerado eficaz, os fármacos alvo devem se unir às enzimas ou receptores com grande afinidade e especificidade.

Resolva para K:

K = x/[E Õ • – x] [D Õ • – x] (2)

Kx 2 – x (K [D Õ • ] + K [E Õ • ] + 1) + K [D sub Õ • ] [E Õ • ] = 0 (3)

Determinação da quantidade de etídio ligado (quantidade de complexo, C):

A obs = μ b x + f [E Õ • – x] (4)

μ b (480 nm) = 2,497 M -1 cm -1

μ f (480 nm) = 5,600 M -1 cm -1

  1. PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS :

MATERIAIS:

  • Solução-mãe de DNA 2 mM (bp) com tampão BPES
  • solução de reserva de ADN de 2 uM (pb) com tampão BPES
  • Solução-mãe de 10 uM de brometo de etídio
  • Micropipetas
  • Tubos de microcentrífuga
  • Espectrômetro de absorvância

PROCEDIMENTOS:

Determine o volume da solução de DNA de estoque e a quantidade de buffer necessária para cada uma das dezenove amostras antes de prosseguir. * Consulte tabelas de dados *

Nos tubos de microcentrífuga, faça dezenove soluções de DNA de 1 mL diluindo a partir das soluções de reserva de DNA 2 mM e 2 uM com tampão BPES. Em seguida, adicione 10 uL de brometo de etidio às dezenove soluções preparadas. Misturar bem e medir a absorvância a 480 nm. Registre a absorvância para cada uma das dezenove soluções e use as informações para calcular a constante de ligação K.

  1. RESULTADOS:
  1. TABELA DE DADOS:

Absorbância a 480 nm

-Log [bp]

[DNA (bp)]

Solução de DNA do Volume 2 mM (em μL)

Solução de DNA do Volume 2 μM (em μL)

Volume do buffer BPES (em μL)

0,018

3.0

0,001

500.0

XXXXXX

500.0

0,023

3.3

5.01187Ã-10 -4

251.0

XXXXXX

749.0

0,024

3.7

1.99526Ã-10 -4

100.0

XXXXXX

900.0

0,032

4.0

0.0001

50,0

XXXXXX

950.0

0,032

4.3

5.01187Ã-10 -5

25.0

XXXXXX

975.0

0,029

4.7

1.99526Ã-10 -5

10.0

XXXXXX

990.0

0,032

5.0

0,00001

5.0

XXXXXX

995.0

0,031

5.3

5.01187 Ã-10 -6

3.0

XXXXXX

997.0

0,030

5.7

1.99526Ã-10 -6

1.0

XXXXXX

999.0

0,032

6.0

0,000001

XXXXXX

500.0

500.0

0,033

6.3

5.01187Ã-10 -7

XXXXXX

251.0

749.0

0,033

6.7

2.51189Ã-10 -7

XXXXXX

100.0

900.0

0,032

7.0

0,0000001

XXXXXX

50,0

950.0

0,032

7.3

5.01187Ã-10 -8

XXXXXX

25.0

975.0

0,034

7.7

1.99526Ã-10 -8

XXXXXX

10.0

990.0

0,035

8.0

0,00000001

XXXXXX

5.0

995.0

0,035

8.3

5.01187Ã-10 -9

XXXXXX

2.5

997.5

0,033

8.7

2.51189Ã-10 -9

XXXXXX

1.0

999.0

0,030

9.0

0,000000001

XXXXXX

0,5

999.5

  1. GRÁFICO DE DADOS:
  1. CÁLCULOS:

Cálculo de amostra para K:

  • Usando a amostra # 4

Informações conhecidas:

  • A obs = e b x + f [E Õ • – x]
  • A obs = 0.032
  • e b (480 nm) = 2,497 M -1 cm -1
  • [E] inicial = 10 uM = 1,0 × 10 -5 M
  • e f (480 nm) = 5,600 M -1 cm -1
  • [DNA (bp)] inicial = log (bp) = -4.0 = 1.0 Ã-10 -4 M
  • Resolva para X:

A obs = μ b x + f [E Õ • – x ]

0,032 = (2497 M -1 cm -1 ) x + (5600 M -1 cm -1 ) [(1,0 Ã-10 -5 M) – x ]

x = 7.73943 Ã – 10 u -6 M

  • Conecte o valor de x para resolver K:

K = x/[E Õ • – x] [D Õ • – x]

K = (7.739 Ã-10 -6 M) ÷ [(1.0 × 10 -5 M) – (7.739 Ã-10 -6 M)] [(1,0 × 10 -4 M) – (7,739 × 10 -6 M)]

K = (7.73943 Ã-10 -6 M) ÷ [2.26057 Ã-10 -6 M] [9.22606 Ã-10 -5 M]

K = (7.73943 Ã-10 -6 M) ÷ (2.0856148 Ã-10 -10 M 2 )

K = 37108.63 M -1

K = 3.71 Ã – 10 4 M -1

  1. FINAL EXCEL FOLHA DE TRABALHO: Após o refinamento
  1. DISCUSSÃO:

O princípio por trás deste experimento de laboratório foi determinar a constante de ligação do brometo de etidio ao DNA usando as concentrações conhecidas e o valor calculado de X obtido a partir da equação. O brometo de etidio é dito ter uma alta afinidade com o DNA, portanto, o valor esperado para a constante de ligação deve ser grande. No entanto, dois métodos foram utilizados para obter o valor K (constante de ligação). O primeiro método foi usando a planilha do Excel e inserindo nossos dados. O objetivo principal era manipular o valor na célula I24 para ser o mais baixo possível. Após várias trilhas e erros, o valor final da célula I24 foi 0.00011316 e logK foi 3.99, se você tomar o antilog desse valor K seria igual a aprox. 9772.37, que é baixo em comparação com o método dois, que foi feito por cálculo manual. Por cálculo manual, o valor obtido para K foi 37,108,63 M -1 , o que indica que o complexo EB final do DNA foi maior do que o DNA não ligado e EB não ligado. O alto valor da constante de ligação (K), demonstra que existe uma alta afinidade do brometo de etidio com o DNA. Isso se correlaciona com os valores esperados de EtBr, que são relatados entre 10 4 M a 10 6 M.

Usando um buffer que não contém NaCl adicionado, como BPE, terá resultados diferentes do de um buffer com NaCl, como o BPES. O buffer BPE produzirá uma menor constante de ligação que a medida no tampão BPES. Sabe-se que a interação dentro do processo de intercalação é conduzida por fatores eletrostáticos e na seleção das bases (manual de laboratório). A ligação eletrostática do brometo de etidio ao ADN tem uma preferência para a ligação ao esqueleto fosfato da cadeia de ADN. A ligação do ligando de ADN é dependente de sal devido à libertação de contra-iões que é realizada durante a ligação. Isto é indicativo de que o componente de sal no tampão demonstra uma estabilidade relativamente maior no DNA devido à sua preferência ao local de ligação dentro da região do DNA rico em GC. Com isso dito, é evidente que uma carga positiva periférica é essencial para a intercalação. A carga positiva na intercalação diminui à medida que o sistema aromático aumenta.

Como o brometo de etidio, a actinomicina D é outro intercalador conhecido com alta afinidade com o DNA. Embora os dois diferem por meio de sites de ligação. Actinomicina D intercala em locais de GC, o que indica que os dois intercaladores não competirão uns com os outros nos locais de ligação exatos. Portanto, adicionando Actinomicina a uma solução de DNA de testículos de arenque Brometo de etídio, resultando em dois resultados diferentes. Um exemplo do enredo é mostrado abaixo:

O enredo é simplesmente um exemplo do que pode parecer. Há muitas variáveis ​​que devem ser consideradas na escolha do intercalador apropriado. Os fatores a considerar são concentrações de soluções e DNA, tampões, seja uma baixa concentração de sal ou tampão de concentração de sal elevado. A diferença em buffers poderia produzir dois resultados muito diferentes. Outro fator a considerar é a magnitude da absorvância. Todos esses fatores combinados podem dificultar o resultado final, por isso é difícil concluir exatamente como a actinomicina D reagiria em combinação com brometo de etidio para o DNA nesta experiência.

  1. REFERÊNCIAS:
  1. Jeremy M. Berg, J. L. (2015). Biochemistry 8th ed. Kate Ahr Parker.
  2. Eva M. Talavera, Pablo Guerrero, Francisco Ocana e José M. Alvarez-Pez, Determinação fotofísica e direta de constantes de ligação do brometo de etidio complexado para E. coli DNA Appl. Spectrosc. 56 , 362-369 (2002)
  3. Fuller, W., e M. J. Waring. 1964. Um modelo molecular para a interação do brometo de etidio com o ácido desoxirribonucleico. Ber. Bunsen Ges. Phys. Chem. 68: 805-808.
  4. Qiao C, Bi S, Sun Y, Song D, Zhang H, Zhou W (2008) Estudo das interações de antraquinonas com DNA usando brometo de etidio como uma sonda de fluorescência. Spectrochim Acta A 70: 136-143
  5. Graves, D. E., C. L. Watkins e L. W. Rendimento. 1981. Brometo de etidio e seus análogos fotorreactivos: análise espectroscópica de propriedades de ligação ao ácido desoxirribonucleico. Bioquímica. 20: 1887-1892. [ PubMed ]
  6. Suh D, Chaires J B (1995) Critérios para o modo de ligação dos agentes de ligação do DNA. Bioorg Mediclin Chem 3 (6): 723-728

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